【Neuron】新机制！丘脑-纹状体环路功能紊乱引发帕金森病
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，常见于老年人，平均发病年龄为60岁左右。我国65岁以上人群中PD的患病率约为1.7%，多数患者为散发病例，仅有不到10%的患者有家族史。PD在临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。
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为治疗PD，科研工作者对PD相关的神经环路机制已开展大量研究，其中富含多棘投射神经元（Spiny projection neuron, SPN）的纹状体为调控PD的重要脑区[1]。SPN包含直接通路SPN（dSPN）与间接通路SPN（iSPN）,在目标引导的运动行为中，dSPN与iSPN的活性会产生一个平衡状态[2]。在PD患者中，上述平衡状态会被打破，偏向于增强iSPN活性，导致运动功能紊乱[3]。但是，对于打破此平衡状态的神经机制，我们知之甚少。
纹状体投射通路
图片来源： Frontiers in Neuroscience[4]
一些研究指出，纹状体接受来自丘脑外侧核（CLn）和丘脑束旁核（PFn）的兴奋性投射[5]，CLn与dSPN和iSPN均产生轴-棘突触，而PFn主要投射到无棘胆碱能中间神经元（cholinergic interneuron，ChI）。这些投射相关功能紊乱均可能是打破dSPN-iSPN平衡状态的因素。
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2019年01月15日，《Neuron》杂志在线刊登了美国西北大学D. James Surmeier教授的最新重要工作[6]，他们发现PFn在纹状体中通过增强对ChI的兴奋性投射来增强iSPN的兴奋性，从而引起PD相关症状，抑制PFn-纹状体投射可减轻PD诱发的运动障碍。本篇文章首次揭示打破dSPN-iSPN平衡状态的神经环路机制，发现引起PD的新神经元亚群，极大提高了人们对PD领域的认知。
D. James Surmeier教授
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1.PD模型鼠中PFn-iSPN兴奋性投射增强
首先，为特异性研究位置毗邻的PFn与CLn到纹状体的投射，作者引入Grp-KH288 Cre小鼠，其中Cre只表达在CLn中。他们在Grp-KH288 Cre小鼠的PFn中注射AAV-Cre-off-ChR2，以6-OHDA诱导多巴胺模型鼠，并通过膜片钳电生理记录纹状体中dSPN与iSPN（图1A-D），发现PD模型鼠iSPN中光激活引发的兴奋性突触后电流（EPSC）幅度更高，而dSPN中光激活引发的EPSC与正常小鼠相同（图1E-J）。
图1 PD模型鼠中PFn-iSPN兴奋性投射增强
(图片来源:Neuron)
2.PFn-iSPN兴奋性投射增强依赖于ChI
接着，作者借助ChR2研究环路连接图谱（subcellular ChR2-assisted circuit mapping sCRACM[7]），令人意外的是，PD模型鼠中PFn轴突在iSPN树突上形成的突触数量与对照组相差无几（图2A-C）。作者推测纹状体的中间神经元参与PFn-iSPN投射。
为验证此假设，作者记录iSPN同时加入河豚毒素（TTX）与4氨基吡啶（4AP）以阻断神经元发放，进而排除多级投射带来的影响。他们发现加入TTX与4AP后，光激活PFn轴突引发的EPSC幅度显著减小（图2D-F）。
过去的研究表明，PFn在纹状体中的下游中间神经元主要为胆碱能中间神经元（ChI）,于是作者通过电生理记录纹状体中ChI。他们发现PD模型鼠中光激活PFn轴突引发的EPSC显著高于对照组，加入TTX与4AP后其幅度进一步增大（图2G-I）。
图2 PD模型鼠中ChI参与PFn-iSPN兴奋性投射的增强
(图片来源:Neuron)
那么，PFn-ChI兴奋性投射增强是否为PFn-iSPN兴奋性投射增强的诱因呢？为回答此问题，作者在ChAT-Cre/D2-Cre小鼠的纹状体中注射AAV-DIO-hM4D，在PFn中注射AAV-ChR2，电生理记录iSPN，发现在PD模型鼠iSPN中，化学抑制纹状体ChI后，光激活PFn轴突引起的EPSC显著减小（图3A-C）。
为进一步研究ChI的功能，作者在ChAT-Cre的纹状体中注射AAV-DIO-ChR2，电生理记录iSPN，发现光激活ChI可产生EPSC，且加入烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）抑制剂后EPSC幅度降低，此现象同时存在于PD模型鼠与正常鼠（图3D-F）。
综上所述，PD模型鼠中，PFn-iSPN兴奋性投射增强主要依赖于PFn-ChI兴奋性投射的增强。
图3 PD模型鼠中ChI放大PFn-iSPN兴奋性投射
(图片来源:Neuron)
为研究nAChR是否参与PFn-iSPN环路，作者记录iSPN同时加入nAChR拮抗剂TMPH，发现PD模型鼠中光激活PFn轴突引起的EPSC幅度显著减小（图4A）。为确定参与此过程的nAChR亚型，他们加入不同类型nAChR拮抗剂，发现只有阻断α6β2* nAChR时EPSC幅度减小（图4B-C）。此外，通过AAV-α6 shRNA降低α6β2* nAChR表达，得到相似结果（图4D-E）。
图4 PD模型鼠中α6β2* nAChR介导PFn-iSPN兴奋性投射增强
(图片来源:Neuron)
为研究nAChR在突触连接中的作用位置，作者通过连续两次光刺激记录双脉冲比值（Paired-pulse ratio, PPR），通常认为PPR越小，突触前释放递质能力越高。他们使用Chronos代替ChR2作为光激活媒介以提高激活频率，发现PD模型鼠中PFn-iSPN投射PPR显著降低，加入α7/α6β2* nAChR拮抗剂MLA后，PPR升至正常水平5A-C）。
然后，作者将记录外液中钙离子置换为锶离子以记录单囊泡递质释放水平，发现PD模型鼠中单囊泡递质释放量更高，此过程也可被nAChR拮抗剂阻断（图5D-H）。
图5 突触前nAChR介导PFn-iSPN兴奋性投射放大过程
(图片来源:Neuron)
4.PFn-iSPN突触增强归因于乙酰胆碱释放量增加
过去的研究表明，PFn神经元具有异质性，其中一个亚群表达Rbp4，且Rbp4不表达于CLn。为研究此亚群功能，作者在Rbp4-Cre小鼠的PFn中注射AAV-ChR2，发现光激活PFn Rbp4+神经元轴突诱发SPN产生幅度高于ChI的EPSC；而光激活所有PFn神经元轴突诱发ChI产生的EPSC更高（图6A-D）。表明PFn Rbp4+神经元倾向于投射到SPN，Rbp4-神经元倾向于投射到ChI，且幅度更高。
针对上述现象，作者假设PD模型鼠中nAChR更多表达于PFn Rbp4+神经元。为验证此假设，作者使用qPCR方法解析nAChR各亚型基因转录水平，却发现并没有任何差异（图6E-F）。于是作者提出又一假设，PD模型鼠中PFn引起乙酰胆碱（ACh）释放水平增加。为验证此，作者加入多巴胺2型受体（D2R）激动剂来抑制Ach释放，发现PFn引起iSPN产生的EPSC幅度显著降低（图6G-H），表明PFn-iSPN突触增强由D2R信号紊乱引起乙酰胆碱释放量增加所致。
图6 PFn-iSPN突触增强由乙酰胆碱释放量增加所致
(图片来源:Neuron)
5.抑制PFn-iSPN环路减轻PD模型鼠运动障碍
若PD模型鼠中PFn-iSPN兴奋性突触增强破坏dSPN与iSPN活性平衡，那么抑制PFn-iSPN环路则会减轻小鼠的PD相关病症。为验证此假设（本篇文章中作者提出了无数大胆假设，这也是科研工作中常见的研究方式，只是会严重困扰本小编
图7 抑制PFn-iSPN环路减轻PD模型鼠运动障碍
(图片来源:Neuron)
PD是步入老年过程中的生理体征之一，其发病机理呈现多样性特点，与个人的遗传、体质、生活环境和习惯等多因素有关。该病症属于人逐步走向衰老的一种正常反映，是目前无法根治的，因此研究其发病机制，刻不容缓。大量研究表明纹状体中dSPN-iSPN平衡状态的打破与PD发病密切相关，但究其神经环路机制，我们尚未可知。本文结合光遗传学、化学遗传学、电生理、行为学等方法，发现PD模型鼠中PFn-ChI兴奋性投射增强以增强PFn-iSPN的兴奋性，PFn Rbp4+神经元倾向于投射到iSPN，抑制PFn-纹状体投射可减轻PD引起的相关病症（图8）。这项研究揭示了打破dSPN-iSPN平衡状态的神经环路机制，为治疗PD提供了新型药物靶点，在不久的将来，人类必将攻克PD这座大山！
图8 PD模型鼠病理示意图
(图片来源:Neuron)
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参考文献
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3.Kreitzer, A.C. and R.C. Malenka, Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature, 2007. 445(7128): p. 643-7.
4.Chen, J.Y., et al., Dopamine imbalance in Huntington's disease: a mechanism for the lack of behavioral flexibility. Front Neurosci, 2013. 7: p. 114.
5.Ellender, T.J., et al., Heterogeneous properties of central lateral and parafascicular thalamic synapses in the striatum. J Physiol, 2013. 591(1): p. 257-72.
6.Leroy, F., et al., A circuit from hippocampal CA2 to lateral septum disinhibits social aggression. Nature, 2018.
7.Petreanu, L., et al., The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature, 2009. 457(7233): p. 1142-5.